電話：
021-67610176傳真：
分為以下兩種方法：
（一）酶標(biāo)抗體法 *直接法 *間接法
（二）非標(biāo)記抗體酶法 *酶橋法 *PAP法
（一）酶標(biāo)抗體法
*通過共價鍵將酶結(jié)合在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，與標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)后，再用酶組化法將酶顯色，使之生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，以供光鏡和電鏡觀察。 -優(yōu)點(diǎn)：切片能長期保存、反復(fù)觀察，適于鏡下半定量分析。
-缺點(diǎn)：酶與抗體形成的共價鍵，可損害抗體和酶的活性；易產(chǎn)生非特異染色。
(1) 酶標(biāo)抗體法——直接法
將酶直接標(biāo)記在一抗上，然后直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合。形成抗原-抗體-酶復(fù)合物，zui后用底物顯色劑顯色。
(2) 酶標(biāo)抗體法——間接法
*將酶標(biāo)記在二抗上，先將一抗與相應(yīng)的抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用二抗(酶標(biāo)抗體)與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，zui后用底物顯色劑顯色。 (a) 酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟 *標(biāo)本準(zhǔn)備： -石蠟脫蠟至水；
-冰凍切片浸入4°C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min×3；
-細(xì)胞爬片先用PBS洗，然后4°C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min×3； *石蠟切片需要進(jìn)行抗原修復(fù)，其它標(biāo)本則不用；
*封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3％H2O2-甲醇溶液室溫孵育5～10min (濕盒內(nèi)) ； *0.01M PBST漂洗，5min×3；
*5～10%正常山羊血清(0.01M PBS稀釋)封閉，室溫孵育30min (濕盒內(nèi)) ；
*傾去血清勿洗，加1％BSA(PBST配制)稀釋的一抗， 37°C孵育60min 或4°C過夜(濕盒內(nèi))；
*0.01M PBST 漂洗，5min×3；
*加HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育lh或37°C 30min ； *加0.01％H2O2~0.05％DAB顯色 (顯色液應(yīng)新鮮配置)；
*經(jīng)PBS漂洗3次后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，明膠甘油封片，顯微鏡觀察。
（二）非標(biāo)記抗體酶法
酶橋法
*首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體； *以二抗作橋，將抗酶抗體聯(lián)結(jié)在一抗上；
*再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)顯色顯示抗原的分布
-優(yōu)點(diǎn)：任何抗體均未被酶標(biāo)記。酶是通過免疫學(xué)原理與酶抗體結(jié)合的。避免了共價連接對抗體和酶活性的損害，提高了方法的敏感性，而且節(jié)省一抗的用量。但抗酶抗體不易純化。
幾點(diǎn)說明
*一抗(假設(shè)來自種屬A)的稀釋度可大些，使抗體的兩個Fab段均與組織抗原結(jié)合。
*二抗——橋抗體(抗種屬A的IgG抗體)應(yīng)過量，使其Fab段一個與一抗結(jié)合，另一個則游離。
*因抗酶抗體與一抗均系種屬A IgG，具有相同的抗原性，所以橋抗體游離的Fab能與抗酶抗體結(jié)合，起橋作用，將其連接在與組織抗原結(jié)合的一抗上。
PAP法
* 與酶橋法相似，不同的是，PAP 法將酶橋法的第 3、4 步并為1步，用PAP復(fù)合物代替。 *PAP是離體制備的復(fù)合物( HRP--抗 HRP)。
*顯色與酶橋法相同，PAP復(fù)合物中的過氧化物酶催化底物水解，形成不溶性終產(chǎn)物。 PAP法評價
*PAP法比直接法、間接法、酶橋法更敏感。特別適用于石蠟切片中微量抗原和抗原性減弱抗原的檢測。
-缺點(diǎn)：步驟較多，時間較長，不適用于臨床常規(guī)檢查。 *由于常做石蠟切片，故可用于回顧性研究。
親和組織化學(xué)法
*是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)。
*這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位。
13224517959
